基质金属蛋白酶（细胞生物学科）

基质金属蛋白酶是一个大家族，因其需要Ca++、Zn++等金属离子作为辅助因子而得名，其家族成员具有相似的结构，一般由5个功能不同的结构域组成 :（1）疏水信号肽序列;（2）前肽区，主要作用是保持酶原的稳定。当该区域被外源性酶切断后，MMPs酶原被激活;（3）催化活性区，有锌离子结合位点，对酶催化作用的发挥至关重要;（4）富含脯氨酸的铰链区;（5）羧基末端区，与酶的底物特异性有关。其中酶催化活性区和前肽区具有高度保守性。MMPs成员上述结构的基础上各有特点。各种MMP间具有一定的底物特异性，但不是绝对的。同一种MMP可降解多种细胞外基质成份，而某一种细胞外基质成分又可被多种MMP降解，但不同酶的降解效率可不同。
　　MMPs几乎能降解ECM中的各种蛋白成分,破坏肿瘤细胞侵袭的组织学屏障，在肿瘤侵袭转移中起关键性作用，从而在肿瘤浸润转移中的作用日益受到重视，被认为是该过程中主要的蛋白水解酶。目前MMPs家族已分离鉴别出26个成员，编号分别为MMP1～26。根据作用底物以及片断同源性，将MMPs分为4类。

　　Ⅳ型胶原酶为其中重要的一类，它主要有两种形式，一种被糖化，分子量为92kD，命名为MMP-9;另一种非糖化，分子量为72kD，被称为MMP-2。当前对MMP-2，MMP-9的研究较深入。
　　MMP-2基因位于人类染色体16q21，由13个外显子和12个内含子所组成，结构基因总长度为27kb，与其他金属蛋白酶不同，MMP-2基因5’旁侧序列促进子区域含有2个GC盒而不是TATA盒。活化的MMP-2定位于细胞穿透基质的突出部位，估计其在酶解细胞间基质成分及基底膜的主要成分Ⅳ型胶原中有“钻头”的作用。
　　此外，已证实MMP-3 和MMP-10能作用于PG、LN、FN、Ⅲ型和Ⅳ型胶原及明胶。MMP-7能作用于明胶和FN。MMP-1的产生范围较广，可由基质纤维母细胞、巨噬细胞、内皮细胞、上皮细胞产生。正常情况下MMP-1阳性率很低，但在各种刺激下可高表达。有研究显示恶性肿瘤中MMP-1高表达与预后相关。
MMPs的活性受到三个水平的调节，即基因转录水平，无活性酶前体经蛋白水解作用而激活以及特异性抑制因子（TIMP）的作用。
一类在一级结构上差异很大，但其活性中心较为保守、含有金属离子(如锌、钴、镍等)，且依靠金属离子催化肽键水解的蛋白水解酶。可被金属螯合剂灭活。

基质金属蛋白酶（matrix metalloprotelnases， MMPs）是锌肽酶家族的一员，广泛分布于植物。脊椎动物、无脊椎动物中，是组成结缔组织细胞外基质降解过程中必不可少的酶，几乎能降解细胞外基质的所有成分。在体内多种生理和病理过程中起重要作用。在创伤愈合、骨质再吸收。怀孕和分娩以及乳腺萎缩等与组织重塑有关的生理过程中均有MMPs 的参与，而在类风湿性关节炎、骨关节炎、角膜溃疡、牙周疾病、动脉粥样硬化、心肌梗死、神经退行性疾病和多发性梗塞等以细胞外基质过度破坏为主要特征的病理过程中MMPs亦发挥重要作用。MMPs 的表达和活化与肿瘤的生长、侵袭和转移存在正相关，在恶性肿瘤中MMPs经常过度表达。基于此， MMPs已成为恶性肿瘤治疗的一个新靶点。

    IMMPs简介
    1．1 三分类及主要生理功能 MMPs家族根据它们的结构和底物特异性可分为：胶原酶（Collagenase，包括 MMPsl， MMPs8和 MMPsl3）、明胶酶（ gelati- nase，包括MMPsZ和MMPs9）、基质溶素（stromelysins，包括MMPs3，MMPs7，MMPs10， MMPsll和MMPs12）、膜型MMPs（MT－MMPs，包括MMPs14，MMPs15，MMPs16和MMPs17）等几个亚群。这些酶联合起来能降解细胞外基质的所有成分，尤其是明胶酶，由于IV型胶原是细胞外基质的主要结构蛋白，而明胶酶是惟一能降解IV 型胶原三螺旋部位的酶，所以明胶酶在肿瘤侵袭转移中占重要地位。
    1．2 MMPs与肿瘤的侵袭和转移的关系 肿瘤侵袭和转移是瘤细胞从原发瘤脱离后向周围或远处组织移动，其步骤包括瘤细胞穿过细胞外基质（extra－ celluar matrix，ECM）屏障、血管壁的基底膜和穿出血管壁进人宿主微环境。大量实验证明，瘤细胞侵袭转移能力与其诱导产生蛋白酶降解ECM。基底 膜的能力密切相关，MMPs是其中最重要的一组酶。 MMPs主要从以下3方面促进肿瘤转移：①降解细 胞外基质。细胞外基质包括胶原、糖蛋白、蛋白多 糖、蛋白酶、细胞因子和黏附因子等，构成肿瘤转移的第一道屏障，MMPs是降解ECM最重要的酶类。 ②促进新生血管的形成。肿瘤组织＞ 2mm时，需要生成新血管为肿瘤继续增殖提供充足的氧气和营养物质。新血管生成是肿瘤迅速增殖和转移的重要条件之一，它与癌转移程度呈正相关。新血管形成的基本步骤包括肿瘤组织释放血管生成刺激因子、血管周围细胞外基质重塑、基膜降解、内皮细胞增殖和迁移、新生血管成型等。在这个过程中MMPs2, MMPs9参与基底膜降解的过程； MMPsI和 MMPs8 能降解Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型胶原； MT1－MMP在内皮细胞表面的表达促使局部胶原和层黏蛋白降解。③调节细胞黏附。肿瘤细胞之间及与宿主细胞之间的黏附在肿瘤侵袭与转移中起重要作用。现已证实，MTI－MMP能活化整合素，进而促进细胞黏附。
    2 MMPs抑制剂
    2．1 种类 包括非特异性抑制剂、组织特异性抑制剂（TIMP）和合成抑制剂。
    α2－巨球蛋白是蛋白酶的非特异性抑制剂，相对分子质量高达 7．50xl05，是通过构象变化阻止酶和其蛋白底物的靠近来抑制酶的活性。但相对分子质量大降低了其组织穿透力，限制了其作为抑制剂的效率。
    TIMP是一种内源性的MMPs组织特异性抑制剂，迄今发现的TIMP家族有4种，即TIMP－1， TIMP－2，TIMP－3，TIMP－4。它们可下调MMPs的活性，对于维持ECM的稳态有重要作用。
     TIMP－l，2，4为可溶性分泌蛋白，TIMP－3是一种结合ECM的非可溶性蛋白。从不同组织中分离 出来的TIMP在蛋白质水平有高度保守的二级结构，通过6个保守的二硫键相连。TIMP分子包括：个区域：一个大三环，即N端区域拥有MMPd抑制 活性；一个小三环，即C端区域，与明胶酶原的蛋白定位或复合物的形成有重要作用。
    TIMP可在多个环节抑制MMPs 作用，如阻 碍MMPs介导的内皮细胞移动；抑制基质中促血管 生成因子的释放，进而抑制血管生成；防止ECM外 降解等。
    尽管TIMP对MMPs有很好的抑制作用，但其作为药物用于肿瘤治疗的前景因其在体内的半衰期太短以及口服生物利用度差而受到限制。
    目前合成MMPs抑制剂种类有10多种，可分为拟肽抑制剂和非肽抑制剂。图1是2类拟肽抑制剂的骨架结构。
    根据Zn2+结合功能基（ZBF）的不同，拟肽抑制剂可分为：异羟肟酸类（－CONHOH）、羧酸类（－ COOH)、次磷酸类[ －PO（oH)-」和硫二亚胺类，此外还包括环状的大环抑制剂、哌嗪二酮类和吲哚 内酸胺类抑制剂，它们在结构上保持了Ⅰ型和Ⅱ型线型骨架的特点，只是在骨架的局部进行了线性连接。非肽类抑制剂包括磺酰胺类、磷磺酰胺类、丙二酰胺类及环状非肽类抑制剂。近年来研究较多的是碳酰胺类。
    除此以外，四环素衍生物也是很有效的MMPs 抑制剂，它们能通过多种途径抑制MMPsI， MMPs3,MMPs13，MMPs2和MMPs9的活性。如传统的多西环素和经过修饰以后的Metastat等，目前正在进行临床试验。
    2．2 治疗肿瘤的现状和前景
    第一代MMPI以巴马司他（batimastat，BB－94）为代表。 BB－94对MMPs具广谱抑制活性，对卵巢癌有一定疗效，因口服生物利用度差改为胸腔或腹腔注射，但发现其诱导急性肠毒性而停用，已基本上被第二代MMPI代替。
    第二代 MMPI主要有tanomastat，prinomastat，马马司他（marimastat），BMS- 275291，其中又以 马马司他在口服生物利用度方面作了很大改进，已经进入Ⅲ期临床试验。但实验表明它能诱发明显的不良反应，包括发热、恶心、呕吐、骨骼肌的疼痛和乏力，以及严重的关节疼痛等。
    2．3 MMPs的结构及其与抑制剂的结合模式 MMPs的结构包括信号肽、前肽区、催化区、铰链区、类血红蛋白调节区以及跨膜区。信号肽的作用是引导翻译后的产物至胞浆内质网，前肽区中含有保守的Pro-Arg-Cys-Gly-Val/Asn-pro-Asp(prcgv/vpd), 它的裂解对于MMPs的激活至关重要。催化区中含2个Zn2+结合位点和至少1个Ca2+ 结合位点。 Zn2+ 结合区中，一个为催化性的，位于活性中心内，涉及MMPs的催化过程；另一个为结构性的。铁链区位于催化区与类血红蛋白结合区之间，以一个二硫健与类血红蛋白结合区末端氨基酸残基相连。类血红蛋白结合区含4个重复序列，与MMPs底物特异性有关。另外MMPs2和MMPs9在催化区中还含有Ⅱ型纤维连接蛋白的插入区。膜型 MMPs （MT－MMPs)在C末端包含一个跨膜区，可以将 MT－MMPs固定在细胞膜上。
    从一级结构及与底物的作用位点看，活化 MMPs重要的结构片段包括：① His 218，His 222， His 228（以 MMPs1编号为准），络合催化部位的锌离子。② Giu 219，作为催化部位的广义酸碱催化剂。③ Ala 182，其羰基氧与肽键的NH形成氨键。 ④ Led 181和 Tyr 240，其侧链将 S1和S3 隔开，并提供供体 NH与底物形成氢键。⑤ Pro 238和Ala 234，其谈基指向S1区域。
    从酶的三维结构来看，MMPs分子包括3个a 螺旋和4个平行，1个反平行β折叠。从与底物或抑制剂作用的模式来看，可分为2个部分：N端催化部位；酶的流水区S1，S1,S2,S3。由于MMPs 高度保守的一种酶，它的各种亚型仪在局部区域有不同，主要体现在酶的S1疏水区，此结构特征成为选择性MMPs抑制剂结构设计的依据。
    最具有代表性的异羟肟酸类抑制剂与MMPs 的结合模式。
    催化部位的 Zn2+ 分别被 HONHCO一中的羟基氧和谈基氧双齿啮合，形成以 Zn2为中心的三角双锥的构型。而羟基和氨基则分别与 Glu219及 Ala 182形成氢键，对抑制剂一复合物的稳定性有很大作用。若羟基烷基化或酰化、则活性下降一个数量级。 P1、P2、P3均为亲脂性基团，其中巴，侧链作用于 S1疏水腔，其结构特性决定了抑制剂的选择性。几个典型的MMPs的疏水区氨基酸见表。
    3寻找MMPs抑制剂的新途径
    3．1计算机辅助药物设计 由于某些MMPs如 MMPsl，MMPs3，MMPs7，MMPss和MMPs9的晶体结构已经研究清楚，因此可以用计算机辅助药物设计即虚拟筛选的方法寻找新的MMPs抑制剂，包括分子对接和全新药物设计。
    分子对接法将小分子配体放置于受体的活性位点处，并寻找合理的取向和构象，使得配体与受体的形状和相互作用的匹配最佳。这种方法主要用来从小分子数据库中搜寻与受体生物大分子有较好亲和力的小分子，进行药理测试，从中发现新的先导化合物。分子对接的软件主要有 Dock和 AutoDock。 Hanessian等.用DOck和AutoDock，基于MMP的晶体结构设计了一系列的MMPs抑制剂。
    全新药物设计是根据生物大分子的三维结构生长出与结合位点相匹配的结构，即获得受体结合部位的结构后，用分子模拟软件如 Sybyl，Insight I Catalyst等，分析结合部位的结构性质，如静电场分布、流水场分布、氢键作用等，然后设计出分子形状和理化性质与受体作用位点相匹配的分子，合成这些分子并测试其生物活性。Shuker等则用其中一种被称为核磁共振（SAR－by-NMR）的方法设计了 MMPs抑制剂。通过一系列测定，发现有2个分子分别与金属锌的结合部位及s1结合部位有好的亲和性。根据这2个分子在MMPs活性部位的结构和位置，发现它们可以用2个亚甲基连接成1个分子，从而发现一种全新的抑制剂分子。目前，计算机辅助药物设计得到的化合物包括AG3340， BAY 12－9566，BMS－275291d等.
    3．2从天然产物中筛选MMPs抑制剂以MMPs 作为靶点来筛选生物来源的MMPs抑制剂也是寻找MMPs抑制剂或先导化合物的重要途径。Bryo－ statins－1就是从海洋生物苔薛虫中分离得到的化合物，对多种人体和小鼠肿瘤具有体内外的抑制活性。在细胞培养中，Bryostatins－1能够诱导分化，并能抑制若干株恶性细胞株的生长。它可能是通过调节 PKC活性而抑制MMPs的活性，故有很好的耐受性.
    Neovastat（AE-941）是从鲨鱼软骨中提取出来的物质，动物实验表明抗肿瘤和抗转移能力都很强，对 MMPall，MMPB和MMPs12有抑制作用。
    4结语
    MMPs是很好的药物靶点，其抑制剂药用前景非常广阔，不久就会有药物正式用于临床治疗中。